液相色谱的进样体积限制

一、核心原则与简单公式

列体积（柱容积）Vc = π d^2 L / 4（d、L 单位 mm；得到的体积为 µL）；

常用经验：分析柱的安全进样体积通常按柱体积的百分比来限制：

保守推荐：0.1%–0.5%（用于溶剂强度高、窄峰要求高或窄内径柱）；

常用范围：0.5%–2%（多数常规 4.6 mm 分析条件）；

宽松上限：2%–5%（若溶剂与起始流动相匹配且需较高灵敏度，可在验证后适当放宽）；

注：这些百分比是体积比例，不考虑样品溶剂强度与固定相载样量。

二、为什么要限制进样体积（主要限制因素）

溶剂效应（样品溶剂比起始流动相“更强”会导致前淌峰或峰形展宽）：强溶剂大体积注入最容易导致峰形劣化；

固定相载样量有限：样品质量过大会造成吸附位点饱和，引起峰拖尾/分裂和分辨率下降；

体系外体积（extra-column volume）：对窄内径柱影响更大，会造成峰变宽，降低有效分离能力；

检测器饱和：高浓度或大量进样导致 UV / MS / ELSD 饱和影响定量线性；

自动进样器/注射环精度与最小可准确体积限制（尤其 µL 以下）；

背压与流速（对微柱/微流路操作时连线和泵的物理限制）。

三、计算与示例（常用柱） 用上面公式先算柱体积，再取推荐百分比：

4.6×150 mm：Vc ≈ 2493 µL → 0.5% ≈ 12.5 µL，1% ≈ 25 µL（常用 5–20 µL）

4.6×100 mm：Vc ≈ 1662 µL → 0.5% ≈ 8.3 µL，1% ≈ 16.6 µL

4.6×50 mm：Vc ≈ 831 µL → 0.5% ≈ 4.2 µL

3.0×150 mm：Vc ≈ 1059 µL → 0.5% ≈ 5.3 µL

2.1×100 mm：Vc ≈ 346 µL → 0.5% ≈ 1.7 µL，1% ≈ 3.5 µL（常用 0.5–5 µL）

1.0×150 mm：Vc ≈ 118 µL → 0.5% ≈ 0.6 µL（微流/纳升级通常为 nL–µL 级）

四、样品溶剂强度对进样体积的影响（关键）

若样品溶剂“比起始流动相弱”（更接近水相、低有机相），可安全注入较大体积；

若样品溶剂“比起始流动相强”（如高 % 有机在低 % 有机起始梯度），即使体积很小也会造成前淌峰。经验规则：当样品溶剂强于起始流动相时，进样体积应显著减小（通常 ≤0.5% 柱容），或用在线富集/trap柱/保留间隙法处理；

梯度和等度的差别：梯度起始为弱溶剂时可用稍大体积（因为梯度“压缩”峰），等度时更敏感。

五、如何判定是否过载或进样过多（现象）

峰宽显著增大、对称性差（尾峰或前峰）、分辨率下降；

保留时间出现漂移或变短（早期淌峰）；

检测器响应非线性或饱和（高浓度情况下特别明显）；

重复进样精密度变差。

六、放大或需要大体积进样时的策略

稀释样品降低溶剂强度，与起始流动相匹配；

改用更大内径或更长柱（提高柱容）或制备柱；

使用在线富集/trap柱（把大量样品先保留在 trap 上，用小体积冲洗后快速切换到分析柱）；

固相萃取（SPE）或前处理浓缩，去除基体并把样品换到弱溶剂中；

大体积进样技术（LVI）：分程注入、样品溶剂挥发（蒸干重溶）或保留间隙（retention gap）——多用于 GC/LC 的专用方法，需验证；

减少系统外体积、使用低死体积接头和短连线，尤其在窄内径柱时。

七、实用建议（方法开发时的检查清单）

先根据柱体积算出 0.5% 与 1% 的体积，作为起始试验值；

检验样品溶剂与起始流动相的匹配度：若不匹配，先做稀释或换溶剂，或把注入体积减为 0.1–0.2% 再观察；

在优化时做注入量梯度（例如 0.1%、0.5%、1%、2%）观察峰形与线性，确定最大允许体积与线性范围；

窄径（2.1 mm 及以下）和 UPLC 列务必尽量小体积进样并最小化外部死体积；

对定量方法在验证阶段明确进样体积、线性范围与检测器饱和点，并写入 SOP。