中药提取物的分离方法建立

总体策略 → 样品前处理 → 分离手段选择 → 色谱条件开发 → 分级/制备放大 → 鉴定与定量 → 方法验证与质量控制 → 常见问题与解决”来组织，便于在实际实验室中操作与决策。

一、总体策略（先明确目标）

明确研究目的：定性（成分鉴定）、定量（指标成分含量）、指纹图谱、分离纯化（制备）或活性导向分离。

明确目标化合物类别（生物碱、黄酮、皂苷、苷类、挥发油、多糖等）及其理化特性：极性、酸碱性、挥发性、热稳定性、紫外吸收/电离能力。

依据目标和样品基质制定分离路线：先“粗分级（溶剂分配/液液分配/SPE）→ 中间分离（柱色谱/开柱、CC）→ 精制（制备HPLC/CCC）→ 鉴定（LC-MS, NMR）”。

二、样品前处理（关键，影响后续分离）

原料粉碎并过筛，记录批次；控制水分避免发霉。

提取选择：依据目标化合物极性选溶剂（挥发油：蒸馏或有机溶剂/SPME；中等极性成分：70%MeOH、EtOH；极极性：水或水提）；可先做小规模单因素试验比较提取率。

粗提/分级：经常使用溶剂渐进提取或溶剂分配（如水提后用石油醚/乙酸乙酯/n-BuOH分层）把样物按极性分级，简化后续工作量。

去除脂溶杂质：若含蜡/脂多，先用石油醚或正己烷脱脂。

固相萃取（SPE）：用于浓缩、去盐或去色素，选择C18、Si、PS-DVB、SCX/SAX等吸附剂按需。

过滤与稀释：进样前0.22–0.45 µm膜过滤，溶剂与流动相匹配（避免溶剂强度过高导致峰形差）。

三、分离手段选择（按目标物理化学性质）

非挥发性小分子（黄酮、苷类、生物碱、皂苷等）：首选反相HPLC/UPLC（C18/C8）；对高度极性者可选HILIC；对强极性或高分子选离子色谱或尺寸排阻（SEC/HPGPC）。

挥发性成分（挥发油、萜类）：GC 或 GC-MS（前处理：蒸馏、SPME、溶剂萃取）。

强极性/无紫外吸收（多糖、极性寡糖）：HPGPC、离子交换或衍生化后用RP-HPLC；多糖用酶或色谱-化学法。

制备分离：中试/制备HPLC、逆流色谱（CPC/HPCCC）、硅胶柱色谱、Flash色谱等。逆流色谱对极性差异小的天然产物非常有效。

四、分析条件开发（以HPLC/UPLC为主）

固定相选择

C18（通用首选），C8（较少保留）、Phenyl（芳香相互作用）、CN/Amide（弱极性或极性互补）、HILIC（强极性）。

流动相与pH控制

常用：乙腈-水或甲醇-水。为改善峰形、提高离子化或稳定性，加入挥发性酸/盐（0.1%甲酸或乙酸、10 mM 甲酸铵/乙酸铵、5–20 mM 乙酸铵/碳酸铵）；用于碱性生物碱可加少量碱（0.01–0.05%三乙胺或碳酸氨），但对MS需选挥发性缓冲。pH对离子化化合物影响大，pH调节能显著改变保留。

起始条件建议（常用分析柱 4.6×150 mm，5 µm）

黄酮/苷类：ACN/水 + 0.1%甲酸，梯度 5% → 60% ACN（30 min），流速 1.0 mL/min，λ 254/280 nm。

生物碱（碱性）: ACN/10 mM NH4HCO3 (pH ~9) 或 ACN/0.05% TEA（调整使碱性化合物呈中性或弱离子化），梯度 5%→60%（30 min），用UV或MS检测。

皂苷（无强紫外）：MeOH/H2O 或 ACN/H2O，检测用ELSD/CAD或MS；梯度 20%→90% ACN/MeOH（视样品）。

多糖/极性小分子：HILIC（ACN高比例）或衍生后RP-HPLC。

检测器

紫外/二极管阵列（DAD）：适合含共轭系统的化合物。

ELSD/CAD：适合无或弱UV吸收的皂苷、三萜类。

LC-MS/MS：用于跟踪、鉴定和痕量定量（选择正/负离子模式）。

方法开发流程（快速迭代）

先做试剂/溶剂相容性与柱选择的 scouting（小样色谱图比较不同柱）。

选一两种候选柱（C18、Phenyl、HILIC），用梯度扫描（短梯度如5→95% ACN 0–20 min）观察成分分布。

优化梯度坡度、起始/终止有机相、流速、柱温与pH以改善关键峰分离。

小心样品溶剂强度对峰形的影响，必要时换溶剂或降低注入体积。

系统适用性指标（SST）

理论板数、尾峰因子、重复进样RSD、分辨率（关键组分Rs>1.5）作为放行标准。

五、分级与制备放大策略

先用溶剂分配/液-liquid提取减低复杂度（可按极性连续分配：石油醚→乙酸乙酯→n-BuOH）。

对中等纯度制备：硅胶柱/ODS开柱分离 → 收集粗分馏（按薄层/分析HPLC监测）。

需要较高纯度：用制备HPLC或CPC/HPCCC（避免固定相吸附，适合洋葱式分离）。

放大注意：放大不是线性按体积缩放（需按填料质量、表面积、线速度和载样量重建条件）；对放大建议做中等放大试验再全放大。

六、鉴定与定量

鉴定：LC-MS/MS（分子量、片段）、NMR（结构确认）、UV/IR 辅助。对未知峰，尽量获得高分辨率MS与MS/MS。

定量：用外标法或内标法；对复杂基质建议用基质匹配标准曲线或标准加入法校正矩阵效应。

指纹/多成分定量：建立指纹图谱并挑选若干指示峰作为质量控制（符合连续批次相似度）。

七、方法验证（参照ICH与药典） 必须评估：特异性/选择性、线性、准确度（回收率）、精密度（重复性/中间精密）、LOD/LOQ、稳定性、鲁棒性/范围。对LC-MS还需评估基质效应与离子抑制。给出典型阈值：回收率 90–110%（可根据目标调整），RSD ≤2–5%（含量测定通常 ≤2%）。

八、常见问题与解决

峰拖尾：检查pH（弱酸/碱被吸附）、使用竞争性洗脱剂、改用端胺化或低残留硅胶柱、减少硅胶上羟基暴露（用TEA微碱或甲酸铵）。

峰分裂/宽峰：样品溶剂太强、注入体积过大、体系外体积大（窄径柱注意最小死体积）、柱污染。

分辨率不足：改变梯度斜率、降低流速提高理论板、换柱（更高效或不同选择性）。

基线噪声/漂移（ELSD/CAD）：流动相挥发性不一致或泵不稳定；对LC-MS基线噪声检查溶剂纯度与脱气。

含盐/基质抑制LC-MS：用SPE或稀释、改用其他离子化模式（APCI）、优化洗脱梯度减少基质共洗脱。

目标峰无UV吸收：改用ELSD/CAD或MS检测，或化学衍生化赋予紫外/荧光性质。

九、质量控制与记录

建立样品前处理 SOP、色谱方法 SOP、系统适用性测试 SOP。

保存原始色谱数据、样品制备记录、对照品批次与纯度证明。

对于常规质量控制可建立快速指纹或多指标准测定流程。

十、实用模板（示例起始条件）

黄酮/苷类分析（分析柱 4.6×150 mm, 5 µm）： 流动相 A：水 + 0.1% 甲酸；B：乙腈

梯度：5% B（0–2 min）→ 40% B（2–25 min）→ 95% B（25–28 min）→ 5% B 回平衡（28–35 min）

流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测：DAD 254/280 nm。

生物碱分析（碱性）： A：10 mM NH4HCO3 (pH ~9)；B：乙腈

梯度 5→60% B（0–30 min），流速 1.0 mL/min，检测 UV 或 MS（正离子模式）。

皂苷制备（ELSD/制备HPLC）： A：水；B：甲醇/乙腈混合（1:1）或纯MeOH

梯度 20→90% B（0–40 min），检测 ELSD，制备柱按填料放大。