梯度洗脱

梯度洗脱（gradient elution）是液相色谱中通过随时间改变流动相组成（通常是有机相比例）来优化分离的一种常用技术。下面给出要点、设计原则、常用参数、注意事项与常见问题与解决办法，便于实际应用与优化。

基本概念与目的

定义：在一次色谱运行中按程序改变流动相中有机溶剂（或另一组分）比例，从弱洗脱（保留强）逐步变为强洗脱（促进强保留组分洗脱）。

目的：在单次运行中高效分离极性差异大的组分、缩短保留时间、提高峰容量并改善峰形，适合复杂样品和宽极性范围分析。

常用梯度类型

线性梯度（最常用）：有机相比例随时间线性增加或减少。

等度-阶跃梯度（step）：保持一段时间后快速跳变，适用于目标峰集中在某区段。

多段梯度：组合几个线性/阶跃段优化复杂样品的分段分离。

关键参数与设计原则

起始与终止条件（%B初始，%B终止）：决定短保留和长保留组分的洗脱窗。常见：小分子反相从5–10% B到95% B；肽类常用2–40% ACN。

梯度时间（tG）：从起始到终止所用时间。短梯度适用于快速筛样，长梯度提高分辨率。

梯度斜率（steepness）：Δ%B / tG（％/min），也与柱体积和流速相关。一般斜率太陡分离差，太缓时间长。

流速（F）与柱体积（Vm）：不同柱规格需按柱体积/流速调整梯度（保持相似的梯度“强度”）。常用做法：梯度时间与柱体积成比例缩放。

冲洗段（high %B）与再平衡（re-equilibration）：结束后通常用高有机冲洗去除强保留物，再回到初始条件并保持足够时间使柱平衡（至少数个柱体积，经验值10柱体积或2–5分钟视柱而定）。

计算与缩放实用公式

梯度速率 = Δ%B / tG（%/min）。

梯度延迟体积（dwell volume或gradient delay）会导致仪器上报告的梯度开始时间与柱实际接收到的时间不同：Vdelay = F × tdelay。需在方法中校正或在不同系统间迁移方法时考虑。

若要在不同柱径/长度或流速之间等效缩放：保持梯度按“柱体积单位”比例缩放（tG_new ≈ tG_ref × (Vm_new / Vm_ref) × (F_ref / F_new)）。

（Vm ≈ π r^2 L ε，ε为柱孔隙率）

常见实践建议（数字化）

初始%B常设为样品中最早洗脱的组分略低于可洗脱的最低有机含量（如5–10%）。

对小分子混合物：常用5–95% B / 10–30 min。

对肽或蛋白消化产物：常用2–40% ACN / 30–120 min以提高分辨率。

冲洗：在终点保持1–3 min高%B（或更长）以洗出强保留或脂类污染。

再平衡：至少10柱体积或方法中设定与起始条件等效的等待时间（UHPLC建议更严格）。

仪器与流动相注意事项

梯度泵和混合器需工作良好以保证比例准确性；小流量系统对延迟体积敏感。

使用可混溶、低吸光的溶剂和透明缓冲体系（LC–MS用挥发性盐如甲酸/乙酸/氨水），避免非挥发性盐造成柱与MS污染。

溶剂需脱气、过滤以避免气泡与噪音。

对检测器（如ELSD/RI）梯度会带来基线漂移或基线变化，选择适当检测器或用参考/基线校正。

LC–MS 特别注意

使用挥发性缓冲（甲酸、乙酸、甲酸铵等），避免三甲胺或磷酸盐等非挥发性组分。

梯度初始高水相（低有机）会在ESI中造成雾化/信号变化，注意起始溶剂强度与离子化效率的兼容。

在样品流入MS之前可将前段废液弃掉（divert valve），仅在目标洗脱窗口传送到MS以减少污染。

常见问题与排查

峰拖尾或峰形变差：检查起始/终止溶剂强度、进样溶剂与起始流动相是否不相容、柱污染或柱温问题。

基线漂移：溶剂吸光、缓冲盐溶度变化、脱气不充分或泵混合不均。

峰丢失或提前：梯度延迟体积或进样溶剂造成的溶媒效果；确认系统dwell volume并校正时间。

重现性差：再平衡不足、泵脉动、温度波动或样品吸附。

优化策略（实用步骤）

用标准混合物做快速线性梯度扫描（不同起始/终止/时间）观察分离窗口与峰容量。

若早期峰拥挤，可降低起始%B或增加前段流速/等度延长；若晚期峰保留过强，可加快梯度后半段或提高终点%B。

逐步细化：先粗调（时间尺度与%范围），再微调（斜率、中间阶跃、冲洗时间）。