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HPLC中三元泵与二元泵的比例换算与三元泵的优势
Part 1 比例换算原理及示例 在HPLC中，三元泵（也称三通道）与 二元泵（也称双通道）的比例换算是方法转移或仪器适配的常见操作。以下简述换算逻辑、步骤及注意事项： 核心原则 1. 三元泵梯度：可独立控制A/B/C三通道比例（如A:水相、B:有机相、C:酸或缓冲盐溶液）。 2. 二元泵限制：仅能控制A/B两通道比例，需将三元中的一种溶剂预混合到A或B通道中。 换算步骤（以预混法为例） 目标：将三元泵方法（如A/B/C通道）转移到二元泵（如A/B通道）上运行。 1. 识别恒定比例溶剂 分析三元梯度表，找到“比例不变”或“与另一通道同步变化”的溶剂（以下以C通道为例）。 前提：C溶剂与A或B的相对比例在梯度中不能独立变化（否则无法精确转换）。
观察到C通道的比例不变，则可合并，二元梯度如下：
示例2：B通道与C通道比例同步变化 如以下三元梯度：
该情况下B通道与C通道可视作“一瓶”，预混合各占50%即可，二元梯度如下：
时间
A 水
B 乙腈与1%甲酸水溶液等体积混合
0
80
20
20
50
50
示例3：B通道与C通道比例不同步变化，则可通过起点与终点状态转化为二元，如：
可以观察到该梯度明显不适用于示例1与示例2的方法，此时可以采用以下方法： A瓶：水-乙腈-1%甲酸水溶液=80-10-10 B瓶：水-乙腈-甲酸水溶液=50-30-20 可得二元泵梯度为
示例4：存在分段梯度，则无法转换为二元：
以下案例供大家验算。
Part 2 三元泵相比二元泵的优势 1. 便于对比不同种类或pH的流动相 在开发一个新的分析方法时，通常需要筛选不同的溶剂组合以找到最佳分离效果。例如，可能需要尝试： 不同pH的缓冲液：比如甲酸铵缓冲液（pH3.5）和乙酸铵缓冲液（pH 5.0）。 不同的有机相：比如甲醇和乙腈，它们的洗脱强度和选择性不同。 对于二元泵，如果你想从“乙腈-甲酸铵缓冲液（pH3.5）”切换到“乙腈-乙酸铵缓冲液（pH 5.0）”，你必须手动更换泵B的溶剂瓶，并从泵A的瓶子中倒掉旧的缓冲液，更换新的缓冲液。这需要停机、冲洗系统、重新平衡，非常耗时且容易出错（如产生气泡、残留污染）。
对于三元泵，你可以将三种溶剂预先准备好：例如，A通道为甲酸铵缓冲液（pH3.5），B通道为乙酸铵缓冲液（pH 5.0），C通道为乙腈。只需在软件方法中轻松改变梯度程序，即可实现从“A/C”混合到“A/C”混合的无缝切换。无需手动更换溶剂瓶，大大提升了方法筛选和优化的效率。
2. 轻松实现复杂的多元梯度 某些复杂的分离任务需要三种或更多种溶剂以特定比例参与梯度洗脱。 pH梯度与有机相梯度结合：例如，在分离离子化合物或生物大分子（如多肽、蛋白质）时，可能需要同时改变有机相比例和缓冲液的pH值。三元泵可以设置一个通道为酸性缓冲液，一个为碱性缓冲液，第三个为有机相，从而实现非常精细的分离控制。离子对色谱：需要在运行时动态加入离子对试剂。可以设置一个通道为含水离子对试剂的流动相，另外两个为有机相和水，方便控制离子对试剂的浓度。 对于二元泵，实现这类三元梯度几乎不可能，或者需要预先离线混合好缓冲液，灵活性极差。
3. 方便地调节盐浓度，使方法开发事半功倍 方法开发中，通常需要尝试不同的盐浓度改善分离效果，这一点对于Comix混合作用柱尤为重要。 如以下案例中，通过改变高浓度盐溶液所占的比例，轻松实现了出峰顺序的倒转，可满足不同需求
这也是comix方法开发中常用的手段，即配一瓶高浓度盐溶液（如200mM)，通过改变该相在泵中的比例，来实现对“体系中盐浓度”的控制。
如以下梯度：
时间
A 200mM甲酸铵水溶液（pH3）
B 乙腈
C 水
0
10
10
80
20
15
40
45
同时，参考案例与文献时，也要避免“谈盐色变”，使用的高浓度盐溶液仅仅是三元泵的其中之一，进入色谱柱的流动相是经过充分混合的。体系浓度15mM或20mM盐溶液完全可兼容质谱。 |
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