色谱柱怎么做性能确认？

色谱柱的性能确认（也叫柱性能验证、柱效测试、柱性能评价）是色谱分析工作中一个严肃且关键的质量保证环节。其目的是验证色谱柱分离能力、理论塔板数、峰型和重现性等指标，确保符合分析要求。下面系统介绍液相色谱（HPLC）为主的色谱柱性能确认方法，如果是气相色谱柱原理类似。

一、为何要进行柱性能确认

新柱使用前检验柱子质量（有无出厂缺陷）

排查分离问题是系统还是柱子的原因

长期使用过程中的状态监控

符合仪器/实验室SOP、法规要求，保障结果可靠（实验室认可如CNAS、GLP等会特别强调）

二、常见性能参数及意义

理论塔板数（N）

衡量柱效高低，N值越高分离能力越强，单位长度塔板数又称为柱效（plates/m）。

公式：N = 16 (tR / W)^2

其中tR为峰保留时间，W为峰宽（基线宽度）。

或：N = 5.54 (tR / W1/2)^2，W1/2为半高宽。

分离度（Rs）

反映两个相邻峰分得有多开。

公式：Rs = 2 (tR2 - tR1)/(W1 + W2)

≥1.5为完全分离。

对称因子（As）/尾峰因子

衡量峰型（理想值接近1，1.0~1.3为佳）。

保留时间重复性

用标准样品多次进样，RSD应小于一定标准。

三、柱性能确认的典型方法

1. 制备标准测试溶液

选取厂家推荐或行业通用的标准物：

常见有苯酚、甲苯、甲基苯、安替比林、苯甲酰苯胺等。

节约版可用尿嘧啶、对硝基苯酚等。

环宇Agilent、Waters等厂家常在出厂报告注明推荐测试物和浓度、流动相组成和流速。

2. 按推荐色谱条件进样分析

按厂家方法配流动相、设流速、柱温、紫外检测波长等。

流动相需新鲜、仪器预平衡、避免死体积影响。

进样量和样品浓度适宜，确保峰达到基线分离。

3. 计算关键参数

记录所有色谱峰的保留时间、峰宽、峰面积

按上面的公式分别计算N、Rs、As等参数。

4. 与标准要求比较

厂家说明书或实验室SOP会给出合格的参数范围：

如“理论塔板数≥8000” “分离度≥1.5” “对称因子1.0~1.5”

不合格需做进一步检修或更换色谱柱。

四、举例说明

[例1] 反相C18柱性能确认

标准液：苯酚、甲苯、苯胺混标

流动相：70%甲醇+30%水（体积比）

流速：1.0 mL/min

检测：UV 254 nm

柱温：25°C

操作：

用上述条件上机进样，获得色谱图。

记录苯酚、甲苯等的tR、W、W1/2。

计算N、Rs、As。

对比说明书要求，判断是否合格。

[例2] 制药分析实验室柱效测试（SOP片段）

取约10 µg/mL 苯酚溶液，进样5 µL，记录主峰tR与基线宽度。

计算N = 16 (tR/W)^2，要求N > 10 000。

计算对称因子As，应在0.9~1.3。

Rs用相邻峰，要求>1.5。

五、注意事项

测试用流动相、标准液需新配，避免旧液对柱子污染

上机前系统应清空并平衡

需用厂家推荐的条件，非自创条件（便于和合格标准对照）

形成书面记录，便于质量回溯

六、常见异常与处理

保留时间明显偏移——系统死体积、流动相变化、柱温未控

理论塔板数降低——柱子污染、老化、装填不良，应反冲洗或更换

峰形变差或前后拖尾——进样系统/连接头死体积、柱损伤