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反相色谱（Reverse Phase Chromatography，RP-HPLC）中常用的流动相添加剂主要有以下几大类，具体作用和应用举例如下：
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## 一、缓冲盐/缓冲液（Buffer）
### 1. **常见种类**
- **磷酸盐缓冲液**（如磷酸二氢钠、磷酸氢二钾等，pH 2.0~8.0 范围常用）
- **醋酸盐缓冲液**（如醋酸钠/乙酸，pH 3.0~6.0）
- **甲酸盐缓冲液**（如甲酸钠）
- **三乙胺缓冲液**或类似胺类
### 2. **作用**
- 控制流动相pH，稳定分析组分的离解状态，提高方法重现性。
- 适当缓冲盐可以提高峰形或调节保留时间。
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## 二、离子对试剂（Ion Pair Reagents）
### 1. **阳离子分析常用**
- **三氟乙酸（TFA）**
- **正辛烷磺酸钠（SDS）**
- **磷酸二辛酯（DOPA）**
### 2. **阴离子分析常用**
- **四丁基溴化铵（TBAB/ TBAH）**
- **四乙基溴化铵、四甲基溴化铵等**
### 3. **作用**
- 通过形成疏水性离子对，提高强极性/带电分析物在反相填料上的保留，实现难保留或难分离物质的有效拆分。
- 改善峰形。
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## 三、调节剂/抑制剂
### 1. **常见调节剂**
- **三乙胺（TEA）/ 二乙胺等有机胺**
（常用于抑制碱性化合物与柱上硅醇基残基交互作用，改善峰形。）
### 2. **常用酸**
- **甲酸、乙酸**（常见于LC-MS联用，减少离子抑制）
- **TFA（三氟乙酸）**（强挥发性酸，适用肽、蛋白类分析）
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## 四、金属离子/络合物/螯合剂
### 1. **金属离子**
- **铜(II)离子（Cu2+）**（用于氨基酸手性分离等）
### 2. **螯合剂**
- **EDTA**
（用于螯合流动相中的金属离子，防止色谱柱活性点金属污染，减小拖尾）
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## 五、有机修饰剂（添加量极低）
如
- **乙腈、甲醇**（本身为反相流动相主成分，但微量添加亦有调节保留的作用，通常被归类为主溶剂）
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## 六、防止微生物/抗菌剂
如0.02%叠氮化钠 NaN₃（防止缓冲体系变质，对HPLC柱有腐蚀性，仅供特殊考量）
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## 七、特殊添加剂
- **Brij-35、Tween-80等表面活性剂**（某些加合物分析或蛋白质分析）
- **尿素**等稳定剂（蛋白去折叠）
- **β-环糊精**（手性分离添加剂，增强特异保留）
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## 八、国际常用组合举例
| 用途 | 添加剂示例 | 典型浓度 | 备注 |
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| LC-MS | 0.1% 甲酸 或 0.1% TFA | 0.01–0.1%（v/v） | 甲酸适合MS，TFA易抑制响应 |
| 通用蛋白/肽 | 0.1% TFA | 0.05~0.2% | 改善峰形 |
| 高分子/糖类 | 20 mM 磷酸盐缓冲液 | 10~50 mM | pH调至5~7 |
| 离子对法 | TBAB（2 mM） | 1~10 mM | 分离阴离子物质 |
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## 总结表
| 类别 | 常见添加剂 | 主要作用 |
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| 缓冲盐 | 磷酸盐、醋酸盐 | 稳定pH，改善重现性 |
| 强酸/弱酸 | 甲酸、TFA、乙酸 | 阻止硅醇基作用、改善峰形 |
| 有机胺 | TEA、DEA | 屏蔽硅醇基、改善碱性组分峰形 |
| 离子对试剂 | TBAB, TBAHS, OS, TFA | 分离带电强极性物质 |
| 金属离子 | Cu²⁺、Zn²⁺ | 专用分离（如氨基酸、肽类） |
| 螯合剂 | EDTA | 缓解金属离子的负面影响 |
| 微生物防腐 | NaN₃ | 防止缓冲液发霉、细菌污染 |
| 特殊功能剂 | Brij-35、β-环糊精 | 特定体系或手性分离 |
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**结论**
反相色谱流动相添加剂通过调节pH、离子强度、减少拖尾、改善峰形、提高分离度、抑制非特异性吸附等，在复杂组分分析中发挥着极其重要的作用。选择时需兼顾目标化合物性质、质谱兼容性及检测灵敏度等因素。
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