液相色谱柱再生方法

液相色谱柱在长期使用后，因填料受到污染、堵塞、活性丧失或结构损伤，可能出现柱效下降、柱压升高、峰型变差等问题。除了常规清洗外，再生（regeneration）指采取一系列物理或化学方法，力图恢复柱子的分离性能。再生操作能延长柱子寿命，降低成本。具体方法根据色谱柱类型、污染类型及厂家建议有所不同。现以常见反相C18硅胶柱再生为例，并兼顾其他柱型，详细介绍如下：

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一、再生前的判断

只有在以下情况下建议再生：

1. 常规清洗已无效（参考前三步清洗流程）；

2. 确认柱效下降、出峰变宽事项非仪器、管路等其他问题所致；

3. 色谱柱填料没有严重机械损坏（如柱头塌陷、填料流失）或不可逆化学破坏（酸碱烧效、键合断链）。

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二、反相C18柱再生的常见方法

1. 梯度强溶剂洗脱（深度清洗）

- 在常规清洗基础上，加大体积、加强极性强度冲洗。

- 步骤示例：

 1. 流动相冲洗10 min

 2. 纯水冲洗30 min

 3. 100%甲醇30 min

 4. 100%乙腈30 min

 5. 100%异丙醇（如可兼容）30 min

 6. 纯水-有机溶剂（如50:50乙腈:水）10 min

 7. 如还无效，见后续第2、3步

2. 反向冲洗（Reverse flushing）

- 改变色谱柱流动方向（将柱头与柱尾互换），低流速（≤推荐最大值一半）冲洗20-60分钟，主要用于清除柱头处机械性/颗粒沉积污染。

- 清理完再恢复正向流速、平衡。

> 注意：反冲慎用，仅用于柱子结构允许且严重污染时。部分色谱柱（如带预柱或保护柱）更安全。

3. 化学再生方法

（1）酸/碱冲洗（仅限耐PH宽范围柱）

- 有机盐堵塞/蛋白吸附严重时可用（前提是柱子说明容许）：

 - 0.1–0.2 M NaOH冲洗（针对蛋白、核酸等生物污染物）→纯水→有机溶剂

 - 0.1 M 磷酸或乙酸冲洗（用于碱溶，适宜部分C18）

- 混合溶剂（如甲醇/水/磷酸）能溶解顽固杂质。

（2）THF、二氯甲烷、三氯甲烷等溶剂冲洗

- 对于强疏水/脂类/聚合物污染，用这些有机溶剂“深度浸洗”10–30 min，可恢复部分键合相。

> 注意：大部分硅胶C18柱不建议长期用强极性非指定溶剂，否则可能析胶、脱链。

（3）氧化剂、强酸再生

- 特殊情况下，少数金属/聚合物柱用30%过氧化氢等氧化剂清除有机物，随后大量纯水和有机溶剂恢复。

4. 高温再生

- 部分耐温色谱柱可在高于常用分析温度10–20℃下，以100%有机溶剂（如乙腈或甲醇）低流速冲洗30–60 min，以增加清洁力。

- 需要查说明书，防止柱子密封圈膨胀损伤。

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三、其他模式色谱柱的再生

- 正相硅胶柱：可用合适比例的正己烷/异丙醇/乙腈/甲醇等体系梯度清洗，慎用水溶液，防止柱床崩塌。

- 离子交换柱：依次用梯度盐（低→高离子强度）和水冲洗，封闭剂（如NaCl, NaOH, HCl）适量恢复离子交换基团活性。

- 亲水作用色谱HILIC柱：乙腈-水梯度重复多次，去除盐和强极性残留。

- 凝胶渗透GPC柱：用存储溶剂加强冲洗或厂家推荐溶剂。

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四、再生后评估

- 再生后应以标品跑柱效实验（理论塔板数测试、对称性、保留时间、峰型、柱压）并与初始性能对比，判断再生是否有效。

- 若效果不佳，基本宣告寿终正寝，建议更换新柱。

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五、注意事项

1. 严格遵查色谱柱说明书！再生用的溶剂及pH条件超范围易永久损坏。

2. 操作安全性：强氧化剂、强酸碱溶液需佩戴防护，避开不通风场所。

3. 再生次数有限，多次再生后填料不可逆损伤、化学键键合硅烷化逐步断链，柱效恢复也会递减。

4. 柱头过滤片污染，可取下浸泡独立清洗或者更换柱头筛板（有适配型号时）。

5. 柱流向标贴及时恢复，避免误装。

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六、厂家与文献推荐

- Agilent, Waters, Thermo, Shimadzu等均提供具体“Column Regeneration”指南，请查具体柱型型号说明。

- 《液相色谱实用大全》《色谱柱性能恢复与保养（色谱杂志/色谱论坛）》

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七、操作流程（简化例）

以反相C18柱为例：  

1. 纯水30 min  

2. 100%乙腈（或甲醇）30 min  

3. 100%异丙醇30 min  

4. 0.1 M NaOH（仅耐碱柱）10 min  

5. 纯水30 min  

6. 纯有机溶剂存储

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八、总结

色谱柱再生是延长柱寿命、恢复分离性能的经济措施。科学诊断问题、对症处理，是成功再生的前提。安全规范操作、兼顾柱子材质和说明书要求，否则适得其反。

如需针对某型号柱子、特殊样品污染、具体再生条件，欢迎补充详细信息，获得针对性建议。