核-壳科技时代的高效分析专题（三）固定相互补的选择性

菲罗门

       随着两种新键合相的推出，对Kinetex核-壳填料的进一步研究与产品研发达到了顶点：Kinetex XB-C18和Kinetex C8。  这两种新固定相为现有Kinetex相（Kinetex XB-C18和 Kinetex C8）提供了互补的选择性, 为色谱工作者的超高效分离提供额外的解决方案，对碱性化合物与LC/MS条件特别有用。

简介
       Kinetex核-壳颗粒的几何设计使其能提供超高性能，接近并在某些情况下超过300K板每米，  但却可以在400 bar背压限制的标准HPLC系统上运行。 利用该产品的关键是引进三种不同的键合相，为方法开发者提供选择。C18和 PFP提供互补的反相选择性：C18的分离主要是根据分析物疏水性的差异；而PFP则根据芳香性、疏水性和极性选择性。硅胶HILIC相根据分析物的极性差异提供了正交的分离模式。  虽然这些固定相为大部分的方法开发提供了解决方案，  但我们也开发出了其它互补的固定相，以满足色谱工作者的需要。 XB-C18，键合了交叉丁基，提供不同的保留特性，特别是在低pH下对碱的保留。C8提供了比Kinetex C18低的疏水性，减少了二次相互作用（由于更高的键合密度），  从而改善峰形， 特别是对那些拖尾严重的分析物如碱性药物的代谢物来说。本技术说明将对新 Kinetex 固定相的选择性进行一些一般性研究，以及它们如何补充Kinetex产品的选择性。

材料与方法

       除USP测试标准品购于USP (Rockville, MD)外，所有化学品都购于Sigma Chemical (St. Louis, MO)。溶剂购于EMD (San Diego, CA)。Kinetex不同固定相(C18, XB-C18, C8, PFP 和 HILIC)的色谱柱规格为50 x 2.1 mm 或100 x 4.6 mm(Phenomenex, Torrance, CA)。所有分析都在  Agilent 1100 或 1200 HPLC系统(Palo Alto, CA)上运行， 配有自动进样器、 柱温箱和多波长检测器。 具体方法在每一个应用中列出。

结果与讨论
Kinetex XB-C18 比Kinetex C18
       Kinetex XB-C18是交叉丁基C18键合而不是传统的C18键合，因此提供了比Kinetex C18相独特的选择性。  虽然XB-C18的疏水性仅比Kinetex C18相稍强，但对酸性和碱性化合物的选择性却有显著差异，尤其是在非离子对酸性流动相条件下，  如0.1％的甲酸。Kinetex XB-C18对碱性化合物的保留降低，而对酸性化合物的保留则稍微增加。

       图1描述了在梯度条件下对酸、碱和中性化合物的混合物的不同选择性。当Kinetex C18（图1A）与Kinetex XB-C18（图1B）进行比较时，  可以观察到这些混合物的洗脱顺序发生了明显的变化。在XB-C18上，碱性化合物明显较早的被洗脱下来，而酸性化合物则稍迟。  可以认为这是因为空间位阻的交叉丁基C18和传统键合的C18与硅醇基之间相互作用的不同。Kinetex C18 增加了以硅醇基为作用基础的保留， 表明该相对碱性化合物有更高的选择性，尤其是当使用TFA缓冲液时。对于那些使用甲酸（如LC / MS条件）的应用，Kinetex XB-C18将是首选，以改善峰形，减少碱性化合物的保留。  然而，这些规则并非如此简单，如图2A和2B所示的分析类固醇混合物。此例中并没有碱性化合物，然而它们在Kinetex C18和Kinetex XB-C18柱上的洗脱顺序并不相同。   可能的解释是21-醋酸可的松峰在两种固定相上的洗脱顺序不同是由于它属于酯类，而 21-羟孕酮和雌酮洗脱顺序的不同表明另一机制影响着这两种固定相间的选择性差异。最后，这两种固定相都有独特和互补的选择性，对方法开发柱筛选来说是非常有用的。

Kinetex C8
      虽然多数人认为C8相的疏水性比C18相稍低，但在对Kinetex C18和Kinetex C8选择性差异的研究中发现情况并不如此。Kinetex C8相为用户提供了提升USP方法的机会，使用核-壳填料来替代完全多孔C8柱以获得高通量和高性能。 此外， 从使用Kinetex C8分析某些药物混合物的图（图3）中可以看出，该固定相的选择性与 Kinetex C18  相比并不仅仅是疏水性的降低。相对于中性和酸性分析物，碱性成分的保留发生了变化，但并没有XB-C18 和C18相比较时明显，这种变化使Kinetex C8与其它相相比其选择性处于“中间”。   这种独特的选择性使Kinetex C8成为方法开发柱筛选的另一选择， 特别是适用于那些希望更新现有的使用L7的USP方法的色谱工作者。当需要寻找“实在”的方法时，C8相可以是一个非常优的选择。如图 4A和 4B所示的分析马尿中的兽药。在这些应用中，还使用了Kinetex C18 和 XB-C18,  图中（图4A）马尿中的某些污染物与分析物共同洗脱出来，峰重叠在一起。然而，当使用Kinetex C8时，所有分析物都能与基质污染物分开。 这样的结果进一步表明Kinetex C8相作为一个独特的选择性，  在方法开发中应该考虑使用。

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